Lunatic 应用之——哺乳动物基因组DNA定量
来源:    发布时间: 2018-01-30 15:29   26 次浏览   大小:  16px  14px  12px
背景介绍 在

背景介绍

 

在这篇应用指南中,我们将介绍如何应用Lunatic系统中的DNA Mamm.检测程序来对哺乳动物基因组DNA进行精准定量。DNA Mamm.采用Unmix分析法,通过对样品紫外/可见光吸收光谱进行解析,将由感兴趣的分子贡献的吸收光谱抽取出来,排除杂质吸收的干扰,基于被抽取出来的光谱部分,进而对感兴趣分子进行准确定量。这种分析方法适用于多种提取方法或商品化DNA提取试剂盒提取的、不同哺乳动物样品来源(人或动物血液、唾液、组织或细胞系)的基因组DNAgDNA)。

 

选择检测程序

 

打开Big Lunatic,首先呈现的是样品类型选择界面,选择”DNA”,然后在弹出的界面中Unmix一栏选择DNA Mamm.程序(图1);在Little Lunatic中,可以在应用界面找到该程序(图2)。准确使用Unmix分析,要求始终以超纯水作为空白(Blank)。

1. Big Lunatic 中程序选择界面示意图。后面图片是样品类型选择界面,前面图片展示的是针对之前选定的样品类型,可供选择的检测应用程序



2.  Little Lunatic中基因组检测程序选择按钮


 

结果界面

 

 

Unmix检测程序通过分析紫外/可见光光谱,检测样品中各种成分及含量(图3、图4)。

·        dsDNA (蓝色:感兴趣的分子。这条蓝色光吸收曲线即gDNA40- 45%GC)的光吸收。曲线的A260峰值乘以dsDNA的浓度系数50,即求得样品中dsDNA的浓度。
·        杂质(橙色):在紫外/可见光波段有光吸收的非DNA分子。在附加的细节报告中可以列举出RNAng/μl),硫氰酸盐(mM)、缓冲液成分(OD230)     和苯酚(mM)的浓度。
·        背景(灰色):这条光吸收曲线整合了样品浊度和仪器特定的光吸收效应。附加的背景细节报告为原材料光学影响和血红蛋白/血红素 (吸光度最大的405        nm) 浓度。减去背景吸收光谱,得到样品的吸收光谱(在big Lunatic中是黑 色曲线,little Lunatic中是白色曲线)。
  Residue或者“Quality offit”值(RRSE)即是测量光谱中未能被分辨出的残留成分含量(%),表示数据解析的准确性。这个参数由黄色曲线表示,并且在     光吸收曲线图下方配合百分比具体说明。当检测样品中未被系统识别的残留成分含量高于2.5%,软件即会给出警告标志(红色×)。
原因有三:(
1)样品浊度非常高;
     (
2)未知化学物质存在;
     (
3)样品浓度过低。当出现红色警告标志或者当样品的A260低于0.5ODUnmix检测程序不能给出DNA特定的光吸收曲线,但是会对样品中核酸总体进行定量,给出一条粉色的“total nucleic asids”吸收光谱。总核酸浓度为粉色吸收光谱A260峰值乘以dsDNA 的浓度系数50

3. Big Lunatic结果界面示例。样品经Unmix程序分析后输出光谱曲线及各条曲线对应成分含量。另外,根据样品具体情况,报告中还会体现详细的杂质和/或背景信息。


4. Little Lunatic结果界面示例。样品经Unmix程序分析后输出光谱曲线及各条曲线对应成分含量。另外,根据样品具体情况,报告中还会体现详细的杂质和/或背景信息。

 

 

报告

 

Little Lunatic big Lunatic均可输出多种形式的报告供用户选择:HTML文件、XMLTXTCSV文件(可用MS Excel打开)。此外,big Lunatic还提供XLSXPDF文件。Little Lunatic提供固定的报告模板,而big Lunatic 则比较灵活,允许用户自由选择报告中需呈现的内容。

 

案例研究

 

在本篇案例研究中,我们用“DNAmammalian application”检测程序分析了不同来源和提取方法的样品。同时采用Quant-It PicoGreenThermo Fisher Scientific)方法作为参照,该荧光检测方法可以特异性检测dsDNA含量。

第一组样品为由QIAsymphonyDNA 提取试剂盒(Qiagen)提取的血液样品DNA。检测发现样品在230nm附近有比较高的缓冲盐吸收峰(Figure 6)。第二组样品为由chemagen chemagic DNA cell kitPerkin Elmer)提取的培养细胞DNA。由于培养细胞通常含有大量RNAFigure 7),由A260测得的浓度值高于样品中DNA的实际含量。

在两组实验中,检测到的吸收光谱通过Unmix程序分析校正,减去在紫外/可见光范围内有吸收的杂质含量进而得出更准确的DNA浓度。结果证明,与A260分析法相比,经Unmix程序测定的DNA浓度值同PicoGreen测定值更为接近(Figure 5)。

5. 三种检测方法结果比较:“DNA mammalianapplication”、传统A260PicoGreen。每个样品检测结果为3个重复孔的平均值,误差线表示标准偏差。结果表明,A260测得dsDNA浓度普遍高于PicoGreen的结果,而DNA mammalian application检测结果则更接近PicoGreen的检测结果。


6(左). QIAsymphony试剂盒血液提取DNA检测结果示例。Unmix 检测结果给出了样品缓冲盐A230吸光值。
7(右). Chemagen试剂盒细胞提取DNA检测结果示例。Unmix 检测结果可以检测出RNA含量。